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pUC57 Simple TA/平端通用克隆載體

簡要描述:

pUC57 Simple TA/平端通用克隆載體公司正在出售的產(chǎn)品:非洲爪蟾腎細(xì)胞 附睪分泌蛋白4封閉多肽 豬瘟病毒疫苗株P(guān)CR檢測試劑盒 大鼠腎損傷分子1(Kim-1) ELISA檢測試劑盒 葡萄糖6磷(G6P)活性比色法檢測試劑盒 獨島極地桿菌 艾滋病病毒抗體

更新時間:2024-01-12

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pUC57 Simple TA/平端通用克隆載體

公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷!

貨號

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

A-PJ1085

pUC57 Simple TA/平端通用克隆載體

20T

描述:pUC57 Simple 通用克隆載體采用了 TOPO 酶連接技術(shù),載體預(yù)先偶聯(lián)上 TOPO 酶,當(dāng)加入 PCR 擴增產(chǎn)物后,5 min 就可以完成連接反應(yīng),連接陽性率高。pUC57 Simple 通用克隆載體消除了大部分的常用酶切位點,便于后續(xù)亞克隆。該產(chǎn) 品適用于 Taq 酶擴增的含“A"尾巴和高保真酶擴增的 PCR 產(chǎn)物的連接,載體含有氨芐青霉抗性篩選標(biāo)記。 

注意:RTS DH5α 凍干感受態(tài)在未溶解狀態(tài)下,可于-20℃長期保存(>2 年),已經(jīng)溶解后,請-60℃以下保存(3 個月)。
主要特征
(1)快速連接,最快僅需 5min;(2)操作簡單,僅需加入載體和片段即可;(3)無需藍(lán)白斑篩選,陽性率高;(4)不包含
任何酶切位點,便于后續(xù)亞克?。?)平末端和 A 尾產(chǎn)物通用。
注意:引物不能磷酸化。
測序引物
正向測序引物:M13F(-47): 5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’;
反向測序引物:M13R(-48): 5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’;
操作步驟
1. PCR 產(chǎn)物的純化
1.1 PCR 擴增完畢后,電泳檢測產(chǎn)物,如無非特異性擴增、無引物二聚體、條帶單一明亮,則可采用 PCR 產(chǎn)物純化試劑
盒純化后用于連接。產(chǎn)物不經(jīng)純化也可以進(jìn)行連接,但效果稍差一些。
1.2 PCR 擴增完畢后,電泳檢測產(chǎn)物,如有非特異性擴增條帶或引物二聚體,則必須采用膠回收后用于連接。
1.3 PCR 擴增模板來源于 Amp 抗性質(zhì)粒,則必須采用膠回收后用于連接。
2. PCR 用量和連接時間
PCR 產(chǎn)物大小 PCR 產(chǎn)物用量 載體用量 摩爾比 連接時間 陽性率
0.1~1kb 2~10ng 1 μl 1: 5~10 5~10min >95%
1~3kb 10~20ng 1 μl 1: 5~10 15~20min >90%
>3kb 5ng/kb 1 μl 1: 5~10 30min >85%
3. 連接反應(yīng)
向 0.2 ml EP 管中依次加入如下試劑
成 分 用 量
PCR 產(chǎn)物 0.5~4 μl (用量參考上表)
pUC57 Simple Vector 1 μl
加無菌水至總體積為 5 μl
輕輕吹打混合均勻后,室溫(25°C)孵育 5~30min,通常放置 10min。
關(guān)于 PCR 產(chǎn)物的用量說明:在 PCR 產(chǎn)物回收后(在無法進(jìn)行 NanoDrop 測定濃度的情況下),按照一般的經(jīng)驗可估算產(chǎn)物
的用量,原則為:3 μl 回收產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳后,可清晰判斷的情況下,使用 0.5~1 μl 回收產(chǎn)物(約 5~15 ng)進(jìn)行連
接即可?;厥债a(chǎn)物難以觀察的情況下使用 4 μl 回收產(chǎn)物(約 5~10 ng)進(jìn)行連接。使用過高量的 PCR 產(chǎn)物將會導(dǎo)致連接效
率低下,長斑數(shù)量和陽性率急劇下降。

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PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備?

試劑:
模板DNA:PCR反應(yīng)需要模板DNA,如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等;引物:PCR反應(yīng)的兩個引物,分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域,引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物;dNTPs:PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程,用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增;Taq DNA聚合酶:PCR反應(yīng)需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴增DNA鏈;PCR buffer溶液:對PCR反應(yīng)具有緩沖作用,調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛,可增強PCR反應(yīng)特異性,從而提高反應(yīng)效率;酶切體系:PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟,常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物;
設(shè)備:
PCR儀:用于控制反應(yīng)溫度,保證PCR反應(yīng)時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制;電泳槽:用于分離PCR擴增產(chǎn)物;核酸提取儀:從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是,只有在有序齊全的基礎(chǔ)上,才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實驗:

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個循環(huán)組成,每個循環(huán)包括以下3個步驟:

一、變性:

利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前,通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘,接下來PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復(fù)性:

在DNA雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸:

DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr(來自于嗜熱菌Thermus brockianus)約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化:

1、變性溫度和時間:

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜WC整個PCR擴增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s,再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長,可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復(fù)性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高,產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低,產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時,過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時間,可根據(jù)待擴增片段的長度而定,小于1kb, 1min足夠;大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意,延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后,PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后,PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值,實際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%,因此不管模板濃度是多少,20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,非特異擴增增加。

公司正在出售的產(chǎn)品:

人偏肺病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

白介1受體相關(guān)激-4ELISA試劑盒 IRAK-4免費代測試劑

榛果源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒

豬囊尾蚴PCR檢測試劑盒說明書

蛋白C10ELISA試劑盒 C10免費代測試劑

差異支原體PCR檢測試劑盒供應(yīng)

羅湖病毒(TiLV)核檢測試劑盒

Cylicin2蛋白ELISA試劑盒

馬輪狀病毒PCR檢測試劑盒

甲型流感病毒PCR檢測試劑盒

蛋白激N1ELISA試劑盒

馬輪狀病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

曼那角病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

凋亡信號調(diào)節(jié)激IELISA試劑盒

鴨肝炎病毒通用探針法熒光定量PCR試劑盒

七星庫道蟲染料法熒光定量PCR試劑盒

端錨聚合2ELISA試劑盒

牛流行熱病毒(BEFV)核檢測試劑盒

氣單胞菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒

多肽-N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移7ELISA試劑盒

禽白血病病毒F亞群染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

馬隱秘桿菌PCR檢測試劑盒

二磷尿核苷葡糖醛基轉(zhuǎn)移2家族肽B4ELISA試劑盒

鯉皰疹病毒3PCR檢測試劑盒供應(yīng)

馬腺病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

CELISA試劑盒

諾卡菌核檢測試劑盒

葡萄球菌屬通用PCR檢測試劑盒

紡錘體蛋白2BELISA試劑盒

馬立克氏病病毒2型探針法熒光定量PCR試劑盒

淋病奈瑟菌探針法熒光定量PCR試劑盒

人登革熱(DF)抗體(IgG)試劑盒ELISA

禽白血病/肉瘤病毒PCR檢測試劑盒

牛諾如病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

β萘酚(β-Nph)elisa試劑盒

戈爾迪勒病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

腸出血性大腸桿菌O157:H7血清型染料法熒光定量PCR試劑盒

pUC57 Simple TA/平端通用克隆載體人丙酰羧化β多肽(PCCB)ELISA檢測試劑盒

四角瑞氏絳蟲PCR檢測試劑盒

禽結(jié)核分枝桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

β防御104(DEFB104A)ELISA試劑盒

施氏油脂線蟲探針法熒光定量PCR試劑盒

肉毒桿菌B型(CB-B)核檢測試劑盒

人雌激誘導(dǎo)蛋白PS2 ELISA檢測試劑盒

禽傳染性支氣管炎病毒(AIBV)核檢測試劑盒

 


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